*僅供醫學專業人士閱讀參考

點擊右上方「關注」，準時接收每日精彩內容推送。

種植體相關感染是影響骨科手術成功的主要威脅。儘管各種材料通過產生活性氧(ROS)來清除細菌，但ROS固有的無法區分細菌和細胞的能力顯著限制了效果。

近日，來自南京理工大學的邢曉東、蘇州大學的韓鳳選和李斌教授團隊發現從精氨酸轉化而來的精氨酸碳點(Arg-CD)表現出極強的抗菌和骨誘導活性。為了在感染性骨損傷的酸性環境中以控制良好的方式釋放Arg-CDs，將Arg-CDs與醛透明質酸（HA-CHO）和明膠甲基丙烯醯（GelMA，G）混合，利用席夫鹼反應製備CD/HA/GelMA複合水凝膠（CHG）（圖1）。結果顯示，將精氨酸轉化為零維Arg-CD可以賦予材料特殊的抗菌和骨誘導活性，有利於感染性骨骼的再生。

相關論文「Transformation of arginine into zero-dimensional nanomaterial endows the material with antibacterial and osteoinductive activity」於2023年5月26日發表於雜誌《Science Advances》上。

1. Arg-CDs和複合水凝膠的表徵

首先，通過簡單的熱解方法獲得Arg-CDs。如圖2A所示，Arg-CD呈球形且均勻分散，直徑為~7 nm。紫外-可見吸收光譜在220和305 nm波長處顯示出明顯的吸收峰，表明成功獲得了Arg-CDs（圖2B和C）。FTIR測量HA-CHO是否成功獲得，與HA相比，在1731 cm−1處觀察到新的峰值，這歸因於HA-CHO的C═O延伸（圖2C）。SEM顯示了具有有序且均勻排列的相互連接的大孔的複合水凝膠的形態，但在酸性條件下被破壞（圖2D）。此外，考察了CHG複合水凝膠的Arg-CD釋放特性。在酸性介質中，CHG複合水凝膠在84天內釋放了7.2±4.21%的Arg-CDs，明顯高於中性介質（63.5±2.7%）。這種行為歸因於Arg-CD和水凝膠之間形成的C═N基團的酸響應裂解（圖2F）。

2. 複合水凝膠的細胞形態和活力

為了評估複合水凝膠的生物相容性，將大鼠骨髓間充質幹細胞（BMSC）接種在組織培養板和複合水凝膠上。細胞骨架染色表明，BMSCs在G、HG和CHG複合水凝膠上粘附和擴散有效，具有良好的生物相容性（圖3A）。細胞的形態學圖像顯示BMSCs在複合水凝膠上擴散（圖3B），表明Arg-CD的添加不會影響複合水凝膠的生物相容性。CCK-8測定顯示，所有組中的細胞數量在5天內增加。與其他組相比，CHG複合水凝膠顯著促進了細胞增殖（圖3C）。

3. 複合水凝膠的體外抗菌作用

然後，研究者用金黃色葡萄球菌測試複合水凝膠的抗菌活性。吖啶橙/溴化乙錠（AO/EB）染色結果表明，CHG複合水凝膠上的死菌數量顯著增加（圖4A）。抑制區實驗表明，CHG複合水凝膠的無細菌菌落距離達到約2 mm，比G和HG複合水凝膠長得多（圖4B）。標準平板計數測定結果表明，CHG複合水凝膠上的金黃色葡萄球菌菌落數約為14%，而G和HG複合水凝膠上的金黃色葡萄球菌菌落數分別約為100和93%（圖4C）。此外，G和HG複合水凝膠上的細菌膜完整光滑，G和HG複合水凝膠上的細菌菌落數量要大得多，而CHG複合水凝膠上細菌的結構完整性明顯受損，導致細菌細胞質滲漏和細菌數量減少（圖4D）。抗菌動力學顯示，CHG複合水凝膠迅速消滅活菌，殺菌活性呈時間依賴性（圖4E）。

4. 細菌和細胞在複合水凝膠上的競爭性定植

植入物表面細胞的成功定植有利於成骨，而細菌定植可能會誘發感染。研究者將BMSCs和金黃色葡萄球菌同時接種在複合水凝膠的表面上（圖5C）。SEM圖像表明，CHG複合水凝膠促進了細胞粘附和擴散，其表面的細菌數量非常少（圖5A）。此外，與CHG複合水凝膠相比，G和HG複合水凝膠的細胞內金黃色葡萄球菌數量顯著更高，表明細菌在G和HG複合水凝膠表面生長良好，甚至在BMSCs內內化並存活。相比之下，CHG複合水凝膠顯著保持了BMSCs的活力，而其上的大多數細菌已經奄奄一息並經歷了細胞凋亡，這表明CHG複合水凝膠可能是一種良好的抗菌和促進細胞存活的候選支架（圖5B）。

5. 複合水凝膠在細菌和細胞中的ROS調控

而後，研究者採用複合水凝膠處理金黃色葡萄球菌和BMSCs，並對金黃色葡萄球菌和BMSCs的ROS水平進行定量。與G和HG複合水凝膠相比，暴露於CHG複合水凝膠後，金黃色葡萄球菌和BMSCs的細胞內ROS水平顯著增加（圖6A）。然而CHG複合水凝膠對BMSCs中的抗氧化酶沒有明顯的抑制作用，同時增強了細胞CAT和SOD活性（圖6B和C）。此外，研究者還發現CHG複合水凝膠促進了BMSCs中Sirt1和Sod2的基因表達以及SIRT1和SOD的蛋白質表達（圖6D和E），表明它可以通過上調抗氧化基因和蛋白質來抵抗氧化損傷。總之，CHG複合水凝膠是消除細菌和促進細胞增殖的絕佳候選者。

6. 複合水凝膠上培養細胞的體外成骨作用

之後，研究者在體外檢測複合水凝膠的骨誘導活性。ALP染色表明CHG複合水凝膠顯著上調了ALP的表達（圖7A）。21 d後，CHG組觀察到大量鈣結節。相比之下，在HG和G組中產生的鈣沉積較少（圖7B）。聚合酶鏈反應結果表明，CHG複合水凝膠顯著促進了成骨相關基因的表達（圖7C）。同樣，蛋白質印跡結果表明，CHG複合水凝膠顯著促進了成骨蛋白的表達，表明CHG複合水凝膠有效誘導了BMSC的成骨分化（圖7D和E）。

7. 複合水凝膠促進體內骨形成

然後，研究者將複合水凝膠植入大鼠股骨缺損中以觀察骨形成。在金黃色葡萄球菌組中，術後4周幾乎沒有觀察到骨形成，而在CHG組中觀察到新的骨形成（圖8A）。骨形成結果顯示：CHG組顯著促進骨再生，BV/TV值大於8%（圖8B）。H&E染色和Masson染色同樣表明CHG複合水凝膠可以促進骨形成和骨成熟（圖8C和D）。

8. 複合水凝膠的成骨機理

文章最後，研究者進行了RNA測序。主成分分析表明，與HG和CHG組相比，對照組（Ctrl）表現出明顯的轉錄組譜（圖9A），這意味著複合水凝膠顯著影響了它們上的細胞。基因表達熱圖顯示了HG和CHG組之間的差異基因表達（圖9B）。基因本體分析顯示：Arg-CDs可以通過免疫調節來改善組織再生（圖9C）。一致的基因集富集分析，進一步證實了Arg-CDs在免疫反應中的作用（圖9D）。

綜上，本文成功地製備了零維Arg-CDs和工程化的CHG複合水凝膠，可以在酸性感染性骨損傷微環境中分解以及Arg-CDs的智能控制釋放。釋放的Arg-CDs通過產生過量的ROS來顯著消除細菌，並通過上調抗氧化酶的表達來促進細胞增殖。此外，所獲得的基於Arg-CD的複合水凝膠上調Il10的表達，通過促進M2巨噬細胞極化來促進成骨。由於優異的抗菌活性和骨形成的完美結合，CHG複合水凝膠在感染性骨修復治療中表現出極具吸引力的應用前景，顯著提高了骨植入的成功率。

了解更多

關注「EngineeringForLife」，了解更多前沿科研資訊~