2020年6月，一名88歲的老爺爺由於嚴重的肺病住院治療兩年多時間，病情卻不斷惡化。老年人年齡大了本身免疫力就非常弱，再加上長期插管治療反覆機械通氣，肺部發生了嚴重的細菌感染。並且，患者的肺部已經檢測到了耐碳青黴烯鮑曼不動桿菌（carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii， CRAB），一般的抗生素根本殺滅不了這種細菌。
還有其他辦法嗎？當然，噬菌體可以！
噬菌體，沖吧！
噬菌體是一種專門「感染」並殺死細菌的病毒，噬菌體只要遇到對的細菌就會鑽進細菌體內大量繁殖，最後從內部把細菌「裂開」，釋放出成百上千新的噬菌體。新釋放出來的噬菌體再去感染細菌，產生下一代噬菌體，循環往復直到把所有的細菌斬盡殺絕。
左：噬菌體電鏡照片，圖中黑線為100 nm的標尺，足見噬菌體之小；右：噬菌體生活史（圖片來源：論文作者供圖與網絡；https://www.researchgate.net/figure/Bacteriophage-lytic-life-cycle_fig1_343167119）
中國科學院深圳先進技術研究院馬迎飛研究團隊用噬菌體為患者治療，隨著治療的進行，患者病情逐漸好轉，肺部的耐藥細菌也檢測不到了，X光片下早已經蒼白的肺部也逐漸轉為了堅實的黑色。
X光下病人的肺部從肺炎症狀的白色逐漸轉化為健康的黑色（圖片來源：論文作者供圖）
噬菌體雖好，可還需改進
上面的故事並不是個例，長期患病的病人本身免疫力就十分低下難以抵擋各種細菌的入侵，加之頻繁使用抗生素導致耐藥細菌越來越多，非常容易出現患者被耐藥細菌感染，醫生束手無策，患者無藥可醫的局面。
面對耐藥菌，噬菌體治療往往是最後也是最有效的殺手鐧。但是這樣的殺手鐧還可以改進，比如向噬菌體基因組內插入增加殺傷力的基因，讓噬菌體更能大殺四方。但噬菌體的基因組本身非常小，基因組上還有很多沒用的「冗餘基因」，根本沒空餘位置插入「基因武器」。
這就好比，耐藥細菌是敵人的堡壘，噬菌體是我方坦克要去炸碉堡。科學家想在坦克內部裝上各種新式武器，結果打開車門往裡一看：呦呵，車裡滿滿當當裝了移動餐吧、真皮沙發，可以養魚遛鳥、喝酒泡茶，淨是些沒用的東西占著地方！
基因組裡都是沒用的基因，沒辦法插入新基因，這可不行啊。
連續刪除系統：在不懂坦克的情況下拆坦克
馬迎飛研究員設想，如果把噬菌體基因組上沒用的基因刪除，得到一個儘量精簡的「底盤噬菌體」，這樣就有足夠的位置插入功能基因了，但是這面臨三大挑戰。第一個挑戰是怎樣高通量識別噬菌體的非必需基因，因為四分之三的噬菌體基因組找不到同源序列，使其不能通過信息分析進行非必需基因判斷。第二個挑戰是怎樣篩選具有生長優勢的突變噬菌體，有些噬菌體基因刪除並不會使噬菌體「死亡」，但刪除會嚴重影響噬菌體的擴增（准必需基因）。另外第三個挑戰是逐刪除基因組不同區域是費力和耗時的，特別是同時需要篩選能夠維持穩健生長的突變噬菌體。
簡單來說，科研人員只知道噬菌體的基因組序列卻不知道基因組上哪些基因是無用的；即使知道了哪些基因是無用的，一個一個刪除也非常慢；就算可以很快刪除基因，每刪除一個基因還要測試一次噬菌體的活力，用來評價哪種刪除方案最好。如果真的按這樣的方法一個一個基因刪除再測試，猴年馬月也得不到精簡的「底盤噬菌體」。
精簡噬菌體基因組的難度，大概相當於這個吧（圖片來源：修改自網絡）
近日，《核酸研究》（Nucleic Acids Research）發表了中國科學院深圳先進技術研究院馬迎飛團隊題為Genome-scale top-down strategy to generate viable genome-reduced phages的文章。該工作報導了一種高通量製備底盤噬菌體的方法，解決了上述3個難題，在噬菌體治療和噬菌體合成生物學中具有巨大的潛在價值。深圳先進技術研究院馬迎飛研究員為該文章的通訊作者，其博士生袁盛建為第一作者。
文章上線截圖（文章連結：https://doi.org/10.1093/nar/gkac1168）
接下來我們就詳細解釋下，這套系統是怎麼解決三個難題的。
神奇的CiPGr
在細菌中，有一種對抗噬菌體的防禦系統叫CRISPR。當噬菌體侵染含有CRISPR系統的細菌時，噬菌體的基因組會被切割掉。科研人員可以在細菌中人工設計一套CRISPR系統，當噬菌體進入這種細菌內部，某個特定的基因會有一定概率被刪除。
正是基於CRISPR的原理，馬老師團隊開發了一種自上而下的全基因組簡化方法，稱為基於CRISPR-Cas9的疊代噬菌體基因組簡化方法（CRISPR/Cas9-based iterative phage genome reduction, CiPGr）。
噬菌體基因連續刪除示意圖（來源：論文作者供圖）
團隊設計了5828 種特異的人工CRISPR系統，可以刪除噬菌體上不同的基因。接下來把含有不同人工設計CRISPR系統的宿主菌混合在一起，並和噬菌體混合。
噬菌體會隨機進入一個細菌，然後被刪除一個基因。如果這個基因對噬菌體很重要，噬菌體會無法生存，再也沒辦法逃出細菌。如果被刪除的基因無足輕重，那麼噬菌體會在細菌內繼續繁殖，釋放出很多子代噬菌體，再進入下一個細菌，隨機刪除下一個基因。
實驗流程設計的詳細解釋
誠然，噬菌體裡面有很多倒霉蛋被刪除了重要基因當場「死亡」。但是噬菌體數量非常多，小小一個試管中就有億兆病毒，吞天沃日。這些病毒中總有一些幸運兒恰好只經過了那些刪除無用基因的細菌，最終變成了精簡版的「底盤噬菌體」。並且只有這些幸運兒可以不斷增殖，因此最終得到的噬菌體中，越是能穩健增殖的噬菌體占比越高，剛好起到了篩選的效果。
三個難題被一次性解決，這大概就是演化思路暴力破解的神奇美感。
噬菌體基因連續刪除示意圖。灰色細菌會刪除重要基因，藍色細菌會刪除不重要基因；左上角噬菌體被細菌一系列不重要基因而得到精簡噬菌體，左下角基因被刪除重要基因而無法產生後代。（來源：作者供圖）
CiPGr讓噬菌體更小了，但更強了
CiPGr系統被設計了出來，那麼好使嗎？好使，相當好使。
馬迎飛團隊使用CiPGr成功簡化了四種不同的有尾噬菌體（T7、T4、seszw和selz）的基因組，發現四個不同噬菌體的基因有的從來不會被刪除（必需基因，刪除之後噬菌體無法生存），有的基因很少被刪除（准必需基因，刪除嚴重影響了噬菌體的擴增），還有的基因經常被刪除（說明這些基因對噬菌體的增殖不是很重要）
這些被刪除的基因中，越早被刪除，說明該基因對噬菌體擴增就越不重要。經過不斷刪除，最終得到的最簡底盤噬菌體刪除了8-23%（3.3-35 kbp）的基因組。
之後對這些簡化的噬菌體進行鑑定，發現部分突變株的抑菌或殺菌能力比簡化之前強。實驗團隊把簡化的噬菌體庫與野生型宿主菌（注意是野生菌，沒有CRISPR刪除系統）混合在一起進行培養。經過8次連續轉接後，具有較高侵染效率的突變噬菌體占比會越來越高，其中分離純化出的部分簡化基因組噬菌體比沒有簡化之前，殺死同樣細菌的時間縮短一半以上，戰鬥力翻倍。
CiPGr：我既要又要還要
在CiPGr的操作過程中，有三個很重要的優點：
第一，只需要噬菌體的基因序列，不需要知道具體每個基因的作用。哪些基因重要哪些不重要，無所謂。反正做實驗的噬菌體數量很多，反正刪除重要基因的噬菌體都死掉了，活下來的噬菌體就是刪除了非必須基因的噬菌體。這就可以讓科學家輕鬆地對陌生的噬菌體也進行類似的「基因組精簡」。畢竟得到噬菌體基因序列很容易而了解功能很難。
第二，研究陌生噬菌體時可以利用CiPGr系統對噬菌體進行精簡，幫助科學家判斷哪些基因重要，哪些不重要，更好地研究噬菌體。
第三，得到精簡的「底盤噬菌體」，剛好能留下足夠空間用於噬菌體改造，得到殺傷力更強的噬菌體用於臨床或其他應用。
三個優點層層遞進，既滿足科學好奇心的探索，又一步步回到了我們剛開始的案例；既從生活中來，又到生活中去；既能致知，又能致用。這大概是世界上最完美的，既要又要還要。
參考文獻：
1. Yuan S, Shi J, Jiang J,Ma Y. Genome-scale top-down reduction of phages to generate viable minimal phage genomes. Nucleic Acids Research; 2022, DOI: 10.1093/nar/gkac1168.
2. Tan X, Chen H, Zhang M, Zhao Y, Jiang Y, Liu X, Huang W,Ma Y. Clinical Experience of Personalized Phage Therapy Against Carbapenem-Resistant Acinetobacter baumannii Lung Infection in a Patient With Chronic Obstructive Pulmonary Disease. Front Cell Infect Microbiol. 2021 Feb 26;11:631585. doi: 10.3389/fcimb.2021.631585. PMID: 33718279; PMCID: PMC7952606.
3. Peifen Chen,Ziqiang Liu, Xin Tan, Haijiang Wang, Yiyang Liang, Yingjun Kong, Wenxue Sun, Liqin Sun, Yingfei Ma, Hongzhou Lu. Bacteriophage therapy for empyema caused by carbapenem-resistant Pseudomonas aeruginosa. BioScience Trends; 2022, Volllume16, Issue 2, doi.org/10.5582/bst.2022.01147.
來源：中國科學院深圳先進技術研究院
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